A técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz – DLS (Dynamic Light Scattering) é a técnica por excelência para caracterizar o tamanho de nanopartículas.

Para amostras adequadas e corretamente preparadas, oferece resultados precisos em um minuto ou menos.

Vantagens:

1. fácil de usar
2. medição rápida nas condições ideais - distribuições monodispersas < 1 µm
3. altamente precisa para distribuições monodispersas
4. preço moderado
5. pode incorporar medida de potencial zeta no mesmo aparelho

Desvantagens:

• baixa resolução
• muito lenta acima de 1 µm ou para distribuições complexas
• não opera em meios opacos ou espalhantes de luz

Baseada nas equações de Mie e Rayleigh, calcula uma estatística de distribuição de tamanho de uma população de partículas.

Não mede partículas individuais.

Ideal para látexes, lipossomas, nanoemulsões, proteínas e outros materiais onde a distribuição de tamanho é bastante estreita.

Faixa ideal de utilização: 5 nm a 1 µm. Sistemas com laser de maior potência e/ou detetores APD podem chegar abaixo de 1 nm.

As partículas podem estar dispersas em qualquer líquido transparente e pouco viscoso.

Faixa de tamanho

Alerta! Algumas especificações publicadas (por todos os fabricantes) não informam claramente certos limites intrínsecos à técnica DLS: .

Anos atrás, o marketing de um fabricante teve uma ideia genial: (ab)usar as especificações para bloquear os concorrentes em licitações. Funcionou! Tão bem que todos os concorrentes tiveram que copiar.

É certamente possível detectar partículas de 10 µm em suspensão.

Se o que você quer é detectar a presença (ou ausência) de partículas maiores/ agregados, DLS é excelente, ele detecta quantidades mínimas dessas partículas maiores.

Mas, caracterizar essas partículas por DLS é inviável, o tempo de análise e a incerteza do tamanho são absurdamente grandes. O limite prático real da técnica DLS é um D₅₀ (ou modo) em torno de 1 µm.

É possível medir D₅₀ = 2 µm - a preparação da amostra (concentração e contaminação) tem de ser muito bem controlada e o tempo de integração mais longo.

D₅₀ = 3 µm, ainda possível, mas pouco viável como rotina.

D₅₀ > 3 µm – o vendedor diz que faz? Exija uma demonstração ao vivo com a sua amostra. Talvez seja possível, mas qual a resolução?

Se sua distribuição tiver D₅₀ acima de 1 µm, esse não é um trabalho para DLS.

Resolução de tamanho

DLS é ideal para populações monodispersas, ou seja, com tamanho bastante homogêneo.

Para distribuições bimodais ou multimodais, a diferença de tamanho entre os vários modos tem de ser de pelo menos 3X para ser possível uma separação adequada.

Para distribuições mais complexas, recomendamos o SLS acoplado a um GPC ou HPLC.

As especificações dos fabricantes de equipamento são para partículas de látex de 100 nm, em diluição adequada.

Concentração:

A equação de Einstein-Stokes é válida para diluição infinita. Ela pressupões que o sinal detetado seja resultante de uma única interação com uma partícula. À medida que aumenta a concentração de partículas na suspensão (ou emulsão), aumenta a probabilidade de que um fóton interaja com duas ou mais partículas (Espalhamento múltiplo). A presença de espalhamento múltiplo acarreta erro no diâmetro reportado, tanto maior, quanto maior a concentração.

A concentração ótima para DLS é em geral entre 0,01% e 0,1% em volume.

Alguns fabricantes alegam medir diâmetros em concentrações tão altas quanto 40%. Em nenhum lugar explicam qual a “mágica” utilizada nem a exatidão dos resultados. Talvez possível em algumas amostras, com precisão altamente degradada. Faz sentido uma medida com um erro de 100%? Para a maior parte dos materiais, o limite máximo de concentração é muito mais baixo, entre 1% e 5%, e já com degradação significativa de exatidão.

Se você quer medir em alta concentração ou sua amostra não pode ser diluída sem alterar suas características e o aspecto da suspensão for minimamente turvo, é necessário usar uma variante mais elaborada da técnica DLS, que deteta e elimina espalhamentos múltiplos. Nenhum dos fabricantes mais conhecidos implementa essa técnica, que exige uma óptica bem mais complexa e cara. O NanoLab 3D é o único produto disponível que oferece essa técnica

Veja mais em Correlação Cruzada 3D.

Concentrações extremamente baixas podem apresentar outros problemas, em especial para partículas maiores

Ângulo de medição

Existem três alternativas mais usadas de ângulo de medição, cada uma com vantagens e desvantagens.

Como se comporta espacialmente o espalhamento de luz em função do diâmetro das partículas?

Note que a escalados gráficos é logarítmica, não linear, cada divisão é um fator de 10 de intensidade

D < 50 nm – Equação de Rayleigh – o espalhamento tem intensidade praticamente idêntica em todas as direções.

basta conhecer a viscosidade e temperatura do meio.

 

50 nm < D < 250 nm – uma região mais complicada, de transição. Em 240 nm, a intensidade a 0° é 40 vezes maior que a 180°.

 

D > 250 nm. Espalhamento Mie. Quanto maior o diâmetro, maior a intensidade a 0°, menor a intensidade a 180°. A diferença pode ser de centenas ou milhares de vezes.

Além disso, para cálculo preciso do tamanho, é necessário considerar indice de refração complexo da partícula e sua forma.

 

Não existe a alternativa “ correta”. Existe a alternativa mais adequada ao que você precisa saber.

O aparelho "ideal" deve ter os três ângulos, para o usuário ter a liberdade de escolher a opção mais adequada a cada caso.

• Deteção a 180° (na prática em geral 173°) - privilegia as partículas < 50 nm.
• Deteção a 90° - apresenta um equilíbrio entre partículas menores e maiores.
• Deteção a 0° (na prática em geral 15°) - privilegia as partículas > 250 nm, pode ser útil para deteção de agregados.

Se o seu interesse é em proteínas ou outras partículas menores que 10 nm, o espalhamento a 173° é o mais adequado.

Se sua amostra for monodispersa, não faz diferença o ângulo. O resultado é o mesmo, pode variar o tempo necessário para obter um bom resultado.

Se sua amostra for uma mistura de partículas pequenas (< 50 nm) com partículas acima de 100 nm, o ângulo de 90° em geral dá um valor mais “equilibrado” que o ângulo de 173°, que subestima as partículas maiores.

Se sua amostra for de pequeno diâmetro e você quiser saber se há agregados, eventualmente medidas em múltiplos ângulos dão maiores informações. Maiores detalhes em Guide to Making Useful Measurements of Monoclonal Antibodies (mAbs) with Dynamic Light Scattering .

Não pretendo aqui entrar em detalhes das teorias de Mie e Rayleigh ou equação de Einstein-Stokes.

Se alguém quiser saber mais, existem várias referências online. Por exemplo: https://pt.wikipedia.org/wiki/Espalhamento_dinâmico_de_luz

Para quem estiver interessado em conhecer a teoria mais a fundo, recomendo: "Let There Be Light: Characterizing Physical Properties of Colloids, Nanoparticles, Polymers & Proteins"; Weiner, Bruce B.

Conheça a linha NanoBrook